科研丨中国环科院: 聚苯乙烯微塑料通过重塑肠道微生物群和促进脂肪酸合成引发小鼠肥胖(国人佳作)

  综上所述，0.1 μg/mL的5 μm MPs暴露破坏了小鼠的肠道菌群稳态，这种MPs剂量调节的肠道菌群重塑导致肠道营养的东西吸收增加，这可能逐渐增强了脂肪合成代谢过程(图S12)。

  微塑料(MP)污染已成为一个全球性的环境问题，其对人类健康的有害影响尤其令人担忧。一些研究表明，MP可以渗透进入动物和人体，造成组织功能障碍，但其对代谢的影响知之甚少。在本研究中，作者研究了MP暴露对代谢的影响，根据结果得出不同暴露剂量可对小鼠产生双向调节作用。当暴露于高剂量MP时，小鼠体重显著下降，而最低浓度处理组的小鼠体重变化不大，但相比来说较低浓度处理组小鼠出现超重现象。这些超重的小鼠体内有过量的脂质积累、拥有较好的食欲且活动量较少。转录组测序根据结果得出，MPs上调了小鼠肝脏中的脂肪酸合成。此外，MPs诱导的肥胖小鼠的肠道菌群组成被重塑，这将增强小鼠肠道的营养吸收能力。本研究的结果揭示了小鼠的MP剂量依赖性脂质代谢，并提出了对不同浓度MP的生理反应的非单向模型。这些结果为先前研究中MP对代谢看似矛盾的影响提供了新的见解。

  为了确定MPs的生理作用，我们测量了暴露过程中的小鼠体重。从暴露第3周(图S2)直到实验结束(图1a)，每天以灌胃方式暴露于100 µg MPs的小鼠体重会降低。随后，进一步测定了血清谷氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)评估小鼠的肝损伤所致程度。只有100 µg/d MPs处理组小鼠的AST/ALT浓度明显高于对照组(图S3)，表明肝脏损伤与体重下降相关(图S4)。对于经饮水暴露MPs的各组小鼠，不同浓度的MPs对小鼠体重有不同的影响。0.001 µg/mL MPs处理组小鼠的体重与对照组相当，而0.1 µg/mL MPs处理组小鼠的体重从暴露第6周开始增加(图1a)。然而，当MPs暴露浓度达到1 µg/mL时，小鼠体重增加消失(图1a, b)。当MPs暴露浓度增加到10 µg/mL时，小鼠的体重平均值略低，但其整体的体重曲线与对照组相比无显著差异(图1a, b)。我们计算了不同暴露时间下小鼠的体重增加量。灌胃处理组小鼠早在处理第三周就出现了抑制体重增加的现象(图1c)。对于经饮水暴露的各组小鼠，0.1 µg/mL MPs处理小鼠在第6周出现体重增加并持续到第8周。实验结束时，0.1 µg/mL MPs处理组小鼠最终表现出较高的体重。

  (a) MPs 处理期间小鼠体重曲线周时的小鼠体重；(c)各指定时间点的小鼠体重增长量，3/1表示MPs暴露第3周时的体重减去第1周时的体重。a-c中使用的小鼠，100 µg/d MPs灌胃暴露小鼠，n=6；经饮水暴露MPs的小鼠和对照组小鼠，n=10~12。数据以平均值±SEM表示。与对照组相比，*p0.05，**p0.01。

  接下来，我们试图探索特定浓度下的MPs如何导致小鼠超重。一般来说，肥胖的程度可通过身体成分的变化来检测，包括测量瘦体重和脂肪质量。因此，我们进一步检测了小鼠的身体成分。0.1 µg/mL MPs处理组小鼠的体脂率明显高于对照组(图2a)。这表明MPs可能通过促进脂肪的过度积累而导致超重。使用Micro-CT(微型计算机断层扫描)，我们测量了小鼠的内脏脂肪体积，同样，0.1 µg/mL MPs处理的小鼠内脏脂肪体积更高(图2b)。因此，实验结束后，我们对小鼠进行解剖并剥离出内脏脂肪。0.1 µg/mL MPs处理组的小鼠内脏脂肪重量明显高于对照组(图2c, d)。相应地，100 µg/d MPs灌胃处理组的小鼠内脏脂肪中位数略低于对照组(图2c)。利用免疫组化方法检验测试脂肪细胞，0.1 µg/mL MPs处理组小鼠的脂肪组织中存在更大的脂肪细胞(图2d, e)。综上，这一些数据表明0.1 µg/mL MPs诱导小鼠体内出现更多的脂肪沉积和积累，导致体重增加。

  (a) 0.1 µg/mL MPs处理10周时的体成分 测定(n=11)；(b) MPs处理10周时的内脏白色脂肪组织(WAT)体积测定(n=11)；(c)内脏WAT重量相对于体重的平均值；(d)内脏WAT的代表性图像；(e)脂肪细胞面积测定(n=25~30，对照组和MPs处理10周后的小鼠中各取2只并选择其单个脂肪细胞的4张图片；(f)苏木精-伊红(H&E)染色的WAT切片代表性图像(比例尺为200 μm)。

  在此之后，我们试图评估MPs如何造成小鼠脂肪过度堆积，在后续的实验中，我们将0.1 µg/mL MPs处理组小鼠与对照组进行了比较。为分析小鼠体内的代谢水平，我们在MPs处理6周后使用代谢笼做测量。我们共记录了小鼠3天的代谢指标。结果发现，MPs处理明显地增加了小鼠的摄食量(图3a, b)(图S5)，不仅在小鼠夜间的正常进食期间，而且在白天小鼠应该休息的期间也是如此。然而，这种摄食量增加的现象并不是持续的，在实验的第一天没检验测试到摄食量的差异(图S6b)。相比之下，各组小鼠的饮水量无显著变化(图S6a)。我们还比较了每只小鼠的每日饮水量，MPs没改变小鼠的饮水习惯，它们都表现出相对一致的饮水量(数据未提供)。至于小鼠每日的呼吸熵，MPs处理仅在白天(小鼠夜间)明显地增加了呼吸熵，这一结果与MPs处理小鼠在白天也有更高的摄食量的发现相一致(图3c, d)。此外，MPs处理小鼠与对照组相比表现出更低的活动量，白天和夜间均是如此(图3e, f)。综上所述，本研究之后发现0.1 µg/mL MPs处理增加了小鼠的摄食量，并在各个阶段降低了小鼠的活动量。

  为了进一步探究MPs对小鼠代谢的影响，我们对小鼠肝脏(最重要的代谢器官)进行了全转录组测序(图4a)。对照组和MP处理的小鼠共享超过99.9%成功检测到的reads(图S7a)，表明该转录组谱具有可比性。我们进一步鉴定了差异表达基因(DEGs)，MPs暴露共造成361个基因表达上调，210个基因表达下调(图S7b)。基因本体(GO)富集分析表明，上调表达的DEGs中有15个与能量代谢紧密关联，尤其是脂肪酸代谢过程、单羧酸代谢过程、脂质代谢过程等，其中有6个被显著上调(图4b)。利用KEGG (京都基因与基因组百科全书)对上调的基因进行功能注释分析，发现在能量代谢中，脂质代谢是被增强最多的代谢过程(图4c)。更具体地说，KEGG分析中富集第一的通路是显著上调的不饱和脂肪酸的生物合成(图4d)。脂肪酸延伸途径是第二丰富的通路，但不具有非常明显性(图4d)。

  为了更清晰地显示肝脏代谢流的变化，我们利用转录组数据对比结果进行了代谢可视化分析(图5)。这样我们大家可以展示代谢产物的流动网络，并突出显示了MP处理后明显地增强的代谢产物变化。这些上调的代谢途径大多与脂质代谢有关，尤其是脂质合成中的脂肪酸延伸途径(图5)，几乎整个脂肪酸延伸途径都被激活。同时，嘌呤代谢和嘧啶代谢途径也被上调。

  利用转录组比较结果可视化代谢通量。使用iPath3.0 (对代谢途径进行可视化分析，查看整个生物系统的代谢途径信息。图中的节点代表不同的化合物，边界代表不同的酶促反应，提供了次级代谢产物的生物合成和重要调控途径的概述。

  随后我们检测了MPs在小鼠体内的积累情况。如图6a所示，MPs暴露后小鼠表现出清晰的荧光信号。这些信号分布在小鼠的各内脏组织中，尤其是在胃、肠道和膀胱中(图6a)。然后，在组织水平上，肠道成像显示MPs积累分布在不同的区域(图6b, c)，特别是在一段回肠组织和整个盲肠组织中。MPs处理10周后，MPs进入盲肠组织并积累(图S8)。对盲肠区域16S rRNA基因进行测序，进一步分析0.1 µg/mL MPs处理组和对照组的肠道菌群。结果显示，MPs处理后盲肠内门水平的微生物群组成发生了变化(图6d)(图S9)。具体而言，0.1 µg/mL MPs处理后盲肠内容物中厚壁菌门(Firmicutes)和脱硫杆菌门(Desulfobacterota)数量明显地增加(图6e)。相比之下，与对照组相比，0.1µg/mL MPs处理组的拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度下降(图6e)。MPs调节菌群变化的结果与肥胖相关的肠道菌群一致(图6f)。这会促进肠道对营养的东西的吸收，并可能会引起更多的能量通过肝脏转化为脂肪。对两组小鼠的肠道菌群进行微生物物种水平差异分析(图S10)。MPs处理明显提高了Desulfovibrio、Lachnoclostridium、Eubacterium brachiy、Parabacteroides goldsteinii等10种微生物物种的丰度；而Muribaculaceae、Alloprevotella、Bacteroides acidifaciens、RikenellaceaeRC9、Clostridia vadinBB60等受MPs的影响显著减少。Muribaculaceae受到的调节最为明显。

  为了探究MPs诱导的微生物组分变化可能会引起的肠道微生物功能发生改变，个人会使用BugBase分析检测了微生物组的高水平表型。MPs引起盲肠内容物中革兰氏阳性菌增加，并增强了Contains Mobile Elements的能力(图6g)。此外，MPs处理组表现出潜在致病过程的降低(图6g)。另外，我们还尝试了FAPROTAX功能预测，有9种微生物功能变化高度富集(图S11)。结果发现，与对照组相比，0.1 µg/mL MPs处理组的硫酸盐呼吸和含硫化合物呼吸显著地增强(图S11)。相反，与对照组相比，MPs暴露组的发酵过程和化学异养受到抑制。

  (a)小鼠体内MPs分布的荧光图像，小鼠接受为期10周的0.1 μg/mL MPs暴露。彩虹色带表示MPs的相对荧光强度。(b)胃肠道示意图；(c)胃肠道MPs分布的荧光图像；(d) 0.1 μg/mL MPs暴露后，肠道菌群组成在门水平上的变化(每种颜色代表一个细菌门)(对照组和MPs组小鼠n=3)；(e)盲肠内容物中门水平微生物群的相对丰度；(f) MPs引起的肠道微生物群重塑示意图；(g) 0.1 μg/mL MPs暴露后由BugBase预测的微生物组表型。数据以平均值±SEM表示。与对照组相比，*p0.05，**p0.01。

  研究表明，MPs对不同的生物，特别是水生生物有不同的毒理学影响。然而，目前对于MPs对哺乳动物的影响了解有限，特别是MPs暴露剂量与由此产生的影响之间的关系，这在未来应引起高度关注。本研究利用直径为5 μm的聚乙烯塑料微球模拟环境中的MPs污染，在小鼠模型上开展多浓度MPs暴露实验。根据结果得出，不同剂量的MPs处理会产生不同的结果。具体来说，我们得知相对低剂量的MPs改变了小鼠的脂肪酸合成代谢以及肝脏和身体行为的相关生理指标(图1b、2a、3a)(图S12)。

  肝脏是众所周知的能量代谢中心，通过脂肪的生物合成或氧化来调节能量流动验表明，高剂量的MPs可在肝脏中积累并引发氧化应激，造成体重下降(图S12)。本研究的结果还表明，暴露于相对高剂量的MPs(100 µg/d)会降低小鼠的体重和WAT比率(图1b, 2c)。相比之下，仅0.1 µg/mL的MPs暴露就会导致体重增加和WAT积累增加(图1c, 2c, 2e)。这些根据结果得出，MPs的作用非常大程度上取决于MPs的暴露浓度。MPs对小鼠脂肪代谢具有双向调节作用。最低浓度0.001 µg/mL MPs处理小鼠与对照组几乎一致。相对低剂量的0.1 µg/mL MPs暴露增加了小鼠的体重增长量。然而，随着浓度的增加(图1b)，MPs对组织的损伤作用逐渐增强(图S3)。因此，这可能通过损伤信号的动员来抑制先前信号对脂肪合成的促进，最后导致脂肪合成的减少和损伤的逐渐加重。

  相对低剂量的0.1 µg/mL MPs暴露可增强肝脏能量合成代谢，包括脂肪酸延伸、不饱和脂肪酸的生物合成和脂蛋白(图5)。有趣的是，丙酮酸代谢、嘌呤代谢和嘧啶代谢均同时被增强，这表明代谢平衡发生了变化，能量趋向于脂质合成(图5)。本研究的结果与以往的研究一致。先前针对环境MPs的毒理学研究表明，暴露于0.1 µg/mL的0.5 µm MPs时，小鼠的体重相比来说较高。加工时间和微塑料尺寸选择的差异可能是造成其体重结果变化不显著的原因。此外，Debroas等人报道了0.1 µg/mL和1 µg/mL的MPs暴露均可导致肝脏甘油三酯(TG)含量非常明显升高，这与我们实验结果中关于小鼠肝脏脂肪酸合成(FAS)增强的结果一致(图4b)。我们的肝脏转录组数据揭示了MPs暴露后小鼠肝脏转录谱发生了明显变化(图4d)。MPs暴露后，大多数上调基因参与了关键代谢途径，尤其是脂肪和脂质代谢过程。同样，在Debroas等人的测序结果中，受影响最明显的KEGG通路为PPAR、细胞色素P450、脂肪酸代谢等，以及脂质代谢、脂肪酸代谢等GO项。本研究的富集分析中同样发现了这些代谢途径被富集。总之，我们从独立的实验中获得了MPs对肝脏引发的相同效应，这表明在一定的暴露浓度下富集的MPs具有相似的效应。

  此外，根据肝脏中活化的FAS，我们得知MPs处理小鼠的内脏脂肪积累过多(图2b, c)。这可能是0.1 µg/mL MPs诱发小鼠肥胖的根本原因。然而，我们没发现小鼠的肝脏存在异常现象，既未曾发现脂肪堆积，也未曾发现肝脏肥大(图S4)。这是因为肥胖是一个发展过程，在初始阶段，肝脏合成多余的脂肪并运送至脂肪组织储存。本实验中使用的暴露剂量造成了小鼠轻度肥胖的发展。相应的，本研究的测序根据结果得出，0.1 µg/mL的MPs暴露不可能会引起肝脏应激反应。然而，MPs的暴露剂量显著增加反而会造成小鼠体重减轻(图1a)。这与Lu等人报道的高剂量MPs暴露造成小鼠体重降低的结果相一致。综上所述，动物对不同浓度MPs暴露的生理反应是不同的，只有特定浓度的MPs才会在适当的生长期内造成小鼠的超重。

  最近，人们发现暴露于环境污染物会潜移默化地影响小鼠的行为习惯、健康，甚至诱发代谢性疾病。例如，Chen等人发现，母鼠暴露于PM2.5会诱发雄性后代肥胖。妊娠期和哺乳期暴露双酚A (BPA)会增加非酒精性脂肪肝的患病风险。本研究中，我们得知暴露于MPs会导致体重增加和食物摄入量增加。与此同时，MPs暴露也导致运动活性下降(图3e)，这可能会造成慢性代谢性疾病的潜在风险。

  肠道菌群对运动、饮食、药物和外因十分敏感，人们一致认为肠道菌群对宿主的健康至关重要。此外，肠道菌群失调与脂质代谢紊乱紧密关联。研究表明，在鱼类和小鼠中，MPs暴露会重塑其肠道菌群。近期，Jin等人报道了0.5 μg/mL的50 μm聚苯乙烯MPs可通过增加其厚壁菌门水平和降低拟杆菌门和变形菌门水平来加重斑马鱼的肠道炎症。本研究根据结果得出，0.1 μg/mL的5 μm MPs可改变小鼠的肠道菌群，在门水平上有3类肠道菌群发生了显著变化(图6e)。此外，在本研究中，MPs暴露后厚壁菌门的丰度明显地增加，这与MPs暴露后斑马鱼肠道中的结果一致。实际上，Jeffrey-Gordon等人在研究肥胖与肠道菌群之间的关系时已提出，当肠道中厚壁菌门的数量多于拟杆菌门时，会导致宿主从食物中吸收更多的热量，因此导致肥胖。研究人员发现，肥胖人群的厚壁菌门比正常人群多20%。他们都以为，这种“肥胖细菌”会从食物中吸收多余的热量(能量)，这些热量被身体吸收并储存为多余的脂肪，从而形成肥胖。据我们所知，自2004年这一理论提出以来，我们的研究首次确定了环境风险因素诱发小鼠肥胖的一致结果。综上，MPs诱导的肠道菌群组成变化可能是高能量摄入并以脂肪形式过度储存的原因(图6f)。而厚壁菌门中的Listeria、Staphylococcus、Streptococcus等属于致病菌。与之一致的是，在肠道菌群的功能预测分析中也表明潜在致病的过程存在非常明显差异(图6g)。跟着时间的推移，这可能会引起小鼠的其他生理反应和组织病理学效应。然而，除了浓度外，还有许多因素可影响MPs的生物毒性，包括其化学成分、粒径、形状和电荷。这将不可避免地给本研究的结果带来局限性。

  代谢，特别是脂质代谢，是由多个器官协同作用调控的生理过程。肠道吸收营养的东西和肝脏合成脂肪储存能量都是脂质代谢的重要过程，调节着脂肪的代谢水平。本研究的数据表明，MPs通过调节肝脏脂质合成和肠道营养的东西吸收，从两方面共同促进生物体的脂质合成(图4b, 6e, 6f)。此外，肠道菌群的功能分析显示，MPs显著抑制菌群的致病性(图6g)。这可能会通过减轻免疫反应水平来增强小鼠的食欲。当然，不能排除MPs直接作用于大脑的神经组织来调节小鼠食欲的可能性，因为有几份报告表明，MPs可在大脑中积累。当前的工作更侧重于探索MPs诱导脂质在生物体中过度积累的原因。由于MPs在生物组织中普遍积累，因此从多器官角度探讨MPs的作用将更有意义。

  综上所述，0.1 μg/mL的5 μm MPs暴露破坏了小鼠的肠道菌群稳态，这种MPs剂量调节的肠道菌群重塑导致肠道营养的东西吸收增加，这可能逐渐增强了脂肪合成代谢过程(图S12)。代谢表型复杂且受多种因素的协同调控。在本研究中，我们试图综合分析多组织数据，阐明MPs影响小鼠代谢过程并导致脂肪过度储存的原因。事实上，了解MPs是如何选择性地激活组织中的某些代谢途径仍要进一步的研究。例如，相应的菌群组成变化、肠道细胞的变化，以及这些变化是否与菌群协同吸收营养，都是有意义的未解问题。此外，肝脏中脂肪合成代谢的增强究竟是由于向肠道提供了更多的营养的东西，还是由于在肝脏富集的MPs自身导致的组织功能发生改变，亦或是两者兼有，目前尚不清楚。此外，小鼠体重的增加究竟是由于MPs暴露造成的食欲增加，还是由于肠道和肝脏诱导的全身性激素调节所致也要进一步的探究。综上所述，MPs调节肥胖的机制有待进一步探讨。尽管这项利用小鼠获得的研究结果不能直接外推到人类身上，但它们为MPs风险评估提供了意想不到的见解。